Molekularna identifikacija nukleinskih kiselina postala je uobičajena u kliničkim uvjetima; dobivena brza identifikacija omogućuje ciljano liječenje pacijenta čime se izbjegava prolongirana upotreba empirijske, potencijalno neadekvatne terapije.

Metodama detekcije nukleinskih kiselina otkrivaju se za mikroorganizam specifične sekvence DNK ili RNK izdvojene iz uzročnika. Sekvence/nizovi mogu i ne moraju biti amplificirani in vitro.

Metode detekcije nukleinskih kiselina općenito su specifične i vrlo osjetljive te se mogu koristiti za sve skupine mikroorganizama. Rezultati su brzo dostupni. Budući da je svaki test tipno specifičan za pojedini mikroorganizam, kliničar mora znati dijagnostičke mogućnosti te shodno njima zatražiti izvođenje određene pretrage. Primjerice, ako pacijent ima simptome koji ukazuju na gripu, ali je sezona gripe završila, korisnije je upotrijebiti općenitiji dijagnostički test na viruse (npr. virusnu kulturu) umjesto specifičnog testa na gripu jer su i drugi virusi (npr. virus parainfluence, adenovirusi) mogući uzročnici.

Nedavni napreci doveli su do razvoja multipleks analiza, u kojima pojedinačni test nukleinske kiseline može otkriti i razlikovati ≥ 2 uzročnika. Multipleks testovi su obično manje osjetljivi od kvalitativne analize s pojedinačnim ciljem. Oni također mogu biti manje specifični; neočekivane pozitivne rezultate koji nisu u skladu s kliničkom slikom pacijenta treba razmotriti s oprezom. Multipleks testovi su trenutno dostupni za otkrivanje agensa biološkog ratovanja.

Testovi bazirani na nukleinskim kiselinama su kvalitativni, ali kvantifikacijske metode postoje za određeni broj infekcija (npr, hepatitis B, hepatitis C, HIV, citomegalovirus, human T-stanični limfotropni virus); ove metode mogu biti koriste u dijagnostici i praćenju odgovora na liječenje.

Testiranje bez amplifikacije

Techniques that target nucleic acid sequences but do not require amplification of those sequences are usually restricted to situations in which the organism has been first cultured or is present in high concentration in the specimen (eg, in pharyngitis caused by group A Streptococcus, in genital infections caused by Chlamydia trachomatis or Neisseria gonorrhoeae).

Amplifikacija nukleinskih kiselina

Za tehniku amplifikacije (umnožavanja) nukleinskih kiselina potrebna je vrlo mala količina DNK ili RNK koja se potom višestruko replicira, čime se mogu otkriti sićušni tragovi mikroorganizma u uzorku izbjegavajući potrebu uzgoja u kulturi. Ove su metode osobito korisne za otkrivanje mikroorganizama koje je teško uzgojiti ili identificirati pomoću drugih metoda (npr. virusa, obligatnih intracelularnih uzročnika, gljiva, mikobakterija, nekih drugih bakterija) ili koji se nalaze u malom broju.

Ovi testovi mogu uključivati

• Ciljane amplifikacije (npr. lančana reakcija polimeraze [PCR], PCR reverznom transkriptazom [RT–PCR], amplifikacija pomaka lanca, transkripcijska amplifikacija)

• Amplifikacija signala (npr. pretrage razgranate DNK, hvatač hibrida)

• Amplifikacijska proba (npr. lančana reakcija ligaze, upadač–cjepač metoda, ciklične probe)

• Postamplifikacijska analiza (npr. određivanje nizova amplificiranog produkta, mikromatrična analiza i analiza krivulje taljenja se izvode pomoću PCR–a u realnom vremenu)

Odgovarajuće prikupljanje uzoraka i pohrana prije dolaska u molekularni dijagnostički laboratorij je od kritične važnosti. Budući da je amplifikacijska metoda tako osjetljiva, lako može doći do lažno pozitivnih rezultata zbog zagađenja uzorka ili opreme.

Unatoč visokoj osjetljivosti, lažno negativni rezultati se ponekad dogode ako je bolesnik simptomatičan (npr, u infekciji West Nile virusom). Lažno negativni rezultati mogu se smanjiti:

• Izbjegavanjem uporabe drvenih štapića i vrhova od vate prilikom uzimanja briseva (moraju se koristiti brisevi predviđeni za amplifikacijske testove)

• Žurni transport uzoraka

• Zamrzavanje ili hlađenje uzoraka ako je pretpostavljena odgoda transporta > 2 sata

Zamrzavanje je uobičajena metoda za pohranu uzoraka za testove amplifikacije nukleinskih kiselina. Međutim, uzorke treba čuvati u hladnjaku, a ne zamrznuti kod sumnje na labilne viruse (npr. varicella-zoster virus, virus gripe, HIV-2) ili ako se pretpostavlja da će biti potrebna kultivacija virusa (smrznuti uzorci ne mogu biti iskorišteni za standardnu kultivaciju virusa).